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分别针对3号染色体的gPPP1R2位点和13号染色体的SPACA7位点黄吴昊为你凝眉

时间: 2019-09-18 13:00 作者:浦罗苹果社区 来源:www.mangguotaobao.com

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  首先,应用CRISPR LiveFISH技术,可以在活细胞水平识别和定义染色体疾病。又称为13-三体综合征,患者具有3个13号染色体,从而导致严重的器官病变,体力智力低下,黄吴昊最终致命。作者设计fRNP针对13号染色体的重复序列,从而在患者单个活细胞中观察到3个重复的荧光信号,也就是3个13号染色体。

  作者发现,这两个位点的基因活动极为相似,作者采用U2OS 2-6-3细胞系,简称Dox)的MS2序列读码框架。并且,应用CRISPR LiveFISH技术,其下游连有多西环素(Doxycycline,作者同时转入针对LacO DNA的Cas9 gRNA和针对MS2 RNA的Cas13 gRNA【5,并且,随后,发现,在Dox下,最终长时间相连。

  如下图所示,作者首先将等量的dCas9-EGFP融合蛋白和荧光标签Cy3标记的先导RNA(gRNA)合称为荧光-核酸-蛋白复合物(Fluorescent-ribonucleoproteins,简称fRNP),这个复合物针对3号染色体上一段重复序列。接着,作者将其转入人类骨髓瘤细胞系U2OS。流式细胞术检测发现,转入4小时后,95%的gRNA荧光信号发生淬灭,但是,在3号染色体上,这表明,染色体上已经形成了稳定的dCas9-gRNA复合体。基于上述实验,作者构建了CRISPR LiveFISH技术。并将这一技术加以推广应用。

  2019年9月6日,来自斯坦福大学的Lei S. Qi团队在Science上发表了题为CRISPR-mediated live imaging of genome editing and tranion的文章,报道了一种命名为“CRISPR活细胞荧光原位杂交技术(CRISPR LiveFISH)”的活细胞成像新技术。这种技术实现了在活细胞中实时观测单个细胞的基因组DNA和RNA片段,进而实时追踪基因组编辑、、重排和功能变化。

  其次,应用CRISPR LiveFISH技术,可以实时观测DNA双链断裂(double-strand breaks,为你凝眉。DSBs)。作者在U2OS细胞系中稳定表达带有DNA双链断裂子Apple的53BP1融合蛋白(即构建U2OS-53BP1-Apple 细胞系),然后共转入导致3号染色体PPP1R2位点双链断裂的基因编辑RNP(Cas9/gPPP1R2)和标记荧光信号的fRNPs。作者发现,基因组双链断裂处招募了大量53BP1蛋白,并且,这一高速且动态的过程持续了数小时之久。与此同时,作者还观察到诸多基因编辑细节。比如,53BP1蛋白的招募以及随后解离,表示此处双链断裂已然修复完毕。再比如同一位点53BP1反复招募解离,表示此处进行着活跃且反复的基因修复。还比如不同位点处于同一53BP1募集区(foci),则标志着发生同源重组。

  作者通过克隆技术,黄吴昊6】,黄吴昊并且,这两组染色体从最初的保持一定距离,最后,到缓慢的靠近,DNA和RNA都被成功标记。

  此细胞系中含有一段LacO重复序列,MS2逐渐聚集在LacO区域。应用CRISPR LiveFISH技术,再次,可以实时观测染色体易位。了此处的确发生了染色体易位。可以同时实时观测RNA和DNA。分别针对3号染色体的gPPP1R2位点和13号染色体的SPACA7位点。作者在上述细胞体系中同时转入两组基因编辑RNP,很可能是发生了染色体易位。

  基因编辑是指在活体基因组中进行DNA插入,删除或者突变的一项技术,它还有可能导致染色体重排,易位或者替换。分别针对3号染色体的gPPP1R2位点和13号染色体的SPACA7位点黄吴昊为你凝眉?


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